实用电子显微镜技术二

第三节其他显微技术的发展

扫描隧道显微技术(STM)

利用量子力学中隧道效应产生隧道电流信号，获得反映样品表面原子形态结构和原子排列图象。

具有原子尺度的高分辨率。

可以观察单原子层的实时结构图象，并能在大气、真空甚至液体环境中观察自然状态下的样品表面结构，因而在半导体、金属、无机材料及生物学研究等方面有广阔的应用前景。

原子力显微技术(AFM)

通过微悬臂上的针尖在样品表面扫描，使针尖与凹凸不平的样品表面的顶端原子相互摩擦产生原子力。在扫描过程中，微悬臂的上下起伏与等位面的样品形貌相互对应，所以可通过针尖与微悬臂之间的隧道电流变化，得到样品表面形貌信息。

其分辨率可与透射电镜相比拟。

AFM不但能通过探测原子间作用力观察绝缘体，还可在生物环境中直接观察生物样品表面结构。

激光扫描共焦显微技术

利用共焦光路及激光扫描，在观察较厚样品的内部结构或直接观察细胞时，可使所选定的不同层面每一焦点面影象清晰，从而得到细胞不同切面上的一系列图象，经计算机系统快速分析处理，即可重组出样品三维立体图象，展现细胞瞬间变化的形态结构。

第一章超薄切片技术

透射电镜的生物样品制备的常用方法包括超薄切片、冷冻复型、负染色等。透射电镜靠电子束穿透样品成像，对样品厚度有很高要求。超薄切片方法得到的样品切片厚度为60-nm，冷冻复型膜厚度约为30nm。复型膜制备和样品负染色的实验过程简单、易于操作，而制备超薄切片的过程则比较繁杂。它分为普通超薄切片技术和冷冻超薄切片技术两大类。

第一节普通超薄切片技术

普通超薄切片技术：不需要特殊的冷冻条件的常规包埋切片技术。包括：取材、固定、清洗、脱水、浸透、包埋、聚合、切片及染色等步骤。每一步都关系到实验成功与否，需步步谨慎认真。

具体步骤：

取材——醛类固定液前固定几小时或更长时间——0.1MPBS清洗数次——1%锇酸后固定2h或过夜——0.1MPBS清洗数次——梯度乙醇或丙酮脱水（30％、50％、70％、80％、90％、95％、％、％）——浸透（1：1、1：2、纯包埋剂）——包埋——聚合（37℃12h、60℃48h）——超薄切片——染色（双重染色）

对超薄切片的基本要求

为了获得清晰的电镜图像，超薄切片应达到以下几点要求：

（1）细胞的超微结构得到良好的保存，没有人工假象；

（2）切片厚度一般为50-70nm左右，较薄的切片分辨率较高，但反差较弱，而较厚的切片反差虽好，但分辨率则稍差；

（3）切片的包埋介质不变形、不分解、不升华，可耐受电子束的照射；

（4）切片平展均匀，没有刀痕、皱褶、震颤及染色剂的沉淀污染；

（5）切片染色后，具有良好的反差并可获得清晰的图像

第二节制样前的准备工作

一、实验设计的准备

应充分考虑电镜技术的复杂性和高消耗性等特点，在没有周全的实验设计之前不要轻易的动手进行实验。

应考虑实验是进行一般的超微结构观察还是进行细胞化学或免疫电镜观察，实验涉及的是哪些组织和器官，对取材的组织和器官的部位都要考虑周密。

根据实验目的采用合适的缓冲液、固定液和固定方法。如在细胞化学工作中，一般要求选用二甲砷酸盐缓冲液，一些特定的离子细胞化学技术需要特定的缓冲液。

包埋介质有时也需要考虑，如在免疫电镜时需要低温包埋剂，这样抗原性可以保存得更好。

二实验器具和实验试剂的准备

要考虑到各个环节所需要的玻璃器皿、实验器材以及实验试剂等。

三、实验材料的准备

应根据实验目的选择合适的实验材料

在实验时不仅要有正常组，还需设立与实验组相同条件的对照组

第三节取材与固定

一取材

取材是超薄切片制样的第一步，也是非常关键的一步。

定义：从动植物机体上或从细胞及微生物的培养物中取得所需材料的操作过程。

所需溶液主要有缓冲液、戊二醛等。

所需器材有吸管、封口膜、称量瓶、烧杯、双面刀片和医用剪刀、镊子、牙签、解剖镜等.

“快”：不管是从麻醉或处死动物身上取材，还是临床手术取材，都应注意保持样品的微细结构，使其最大限度的近于生活状态。一定要目标明确，操作迅速，而且使样品必须在离体半分钟或最多2分钟内浸入固定液，以免时间过长，出现细胞自溶。尤其在暑热情况下，还会出现微生物繁殖导致样品腐败，细胞的精细结构当然会全部破坏。

“准”：取材的部位一定要准确可靠，同时还应注意材料的方向性，例如选取肌组织时，就要考虑肌原纤维在将来切片时是纵断还是横断；其它组织当然也要考虑到定位和定向的问题。

“轻”：所谓“轻”，是指一切操作都应始终贯彻动作轻柔，不仅要避免对组织的挤压及钳拉，还要注意器械的锋利，否则将引起组织结构的人工损伤性变化。

“小”：固定液的穿透能力都比较弱，所以为了保持样品近于生活状态的微细结构，取材大小当然要与固定液的穿透速率相适应，一般以1mm3为宜。样品过大时内部固定不良，过小时观察的目标又会受到局限。

“低”：低温操作，4℃，所用试剂、器具均需预冷。

取材方法：

1）动物：将动物麻醉或急性处死，在1-2分钟内解剖出所需要的组织器官，用锋利的解剖刀取小块材料，迅速投入冷的戊二醛固定液中。然后取出放在滴有预冷的戊二醛载玻片上，用新的锋利刀片把材料切成1mm3的小方块，再投入盛有冷的固定液的小瓶中，置4℃条件下进行低温固定。对于某些特殊材料，如神经组织等，应先进行原位固定或灌流固定，待组织适度硬化后再取材。

2）植物：植物组织的取材较容易，离体后的变化不象动物材料那样迅速，但同样要求尽快投入冷的固定液。一般植物叶片常切成宽1mm、长3-4mm的小条。茎和根可切成小条，也可切成1mm3的小方块。表面有毛刺的植物材料，需先用酶处理使之软化，表面有蜡质的叶片在50%乙醇溶液中浸泡几秒至几十秒进行脱蜡，取出后用双蒸水清洗数次，再切取。

3）体外培养细胞的取材：先倒去培养液，然后倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴条件下放置5-10min，弯头滴管吹打或用刀轻轻刮下贴壁的细胞。将含有细胞的固定液转移到离心管中，低速离心10-20分钟，使细胞聚成团块，用擦镜纸包好细胞团块，置于新鲜的固定液中固定。

4）野外取材：冰壶内放一瓶冷的戊二醛固定液，先切取比标准要求稍大的组织块，放入冰壶内保存的固定液中，带回实验室后，按要求切成标准小块或小条进行固定。对于田间植物材料，还可以采集植株保湿带回实验室，再进行取材。

5）骨组织取材：除某些鱼类骨组织可不脱钙，大部分骨组织均需脱钙。用锋利锯条将骨组织锯成约3mm碎骨片，放入固定液中固定过夜或更长时间，缓冲液漂洗后放入脱钙液中脱钙约3周后再切成小块。

二固定

定义：用化学或物理法迅速杀死细胞，使所取材料各种细胞或大分子尽可能保持生活状态的结构，尽可能地减少细胞的死后变化，使细胞及其细胞器的精细结构完好无损地得以保存。

固定的目的：防止组织细胞的离体后变化，防止自溶，以保持组织细胞的成分和结构与其生活状态尽量一致

在固定以后的漂洗、脱水和包埋等样品处理过程中，保护样品使其物质不致溶解和流失为以后样品的处理（包括染色和经受电子束轰击）作准备，并使组织适当地硬化

（一）、固定方法

物理固定法是指用冷、热或微波等物理方法对生物组织进行固定。在超微结构研究中，冷冻固定和微波固定是较为常用的物理固定方法。

化学固定法是采用一定的化学试剂对组织或细胞进行固定。这种化学试剂称“固定剂”。它能和细胞内的大分子物质，主要是蛋白质发生化学结合形成交联，使蛋白成分得以凝固稳定，与此同时也能保存糖类和脂肪，使其保持生活时的状态和位置，从而达到把细胞的精细形态结构保存下来的目的。

理想的固定剂，应具备以下条件：①能迅速而均匀地渗入组织细胞内部，稳定细胞内各种成分；②能即刻将细胞“杀死”，尽可能保持细胞微细结构，减少死后变化；③对细胞不产生收缩及膨胀作用，不产生人工假象及变形；④可保存一定的酶的活性，以利于细胞化学测定工作的进行。

在化学固定过程中，组织微细结构保存的质量不仅受到固定液特性的影响，而且还受到固定组织所使用方法的影响。

1.浸泡固定是最常用的固定方法。组织块切小后，立即浸到大量固定液中。使用青霉素小瓶，每瓶放10块左右组织，固定液2-4ml，4℃固定2-4小时或更长时间。适用于各种实质性器官，如心、肝、肾、肌肉等。

2.原位固定是指在保持实验动物血流不断的情况下，进行固定渗透，避免因为缺氧和死后的组织自溶引起微细结构的变化。将动物麻醉后暴露出所需器官的表面，剥开包膜，将冷的固定液滴加到被取器官上，直至组织达到适当的硬度。或将固定液直接注射到所需固定的组织中或者空腔器官的内部，最后将所需的组织取出作常规浸泡固定。适用于较软的组织（如脑、眼球等）。

3．血管灌注固定利用血液循环的途径将固定液灌注到所要固定的组织中，其特点是固定迅速、均匀。将固定液注入特制的带有针头与皮管的容器中，而后选择到达要取材器官的最短循环途径，将固定液灌注到动物的相应部位。待被灌流的组织适度硬化后，再细致解剖取材，并按浸泡固定法操作。适用于解剖关系比较复杂的组织器官（如垂体、脊髓、甲状旁腺等）。

（二）常用固定液的性质

1．醛类

醛类固定剂包括戊二醛、丙烯醛、甲醛、多聚甲醛等。此类固定剂的特点是对样品的穿透力较强，能固定较大的组织块，既能很好地固定蛋白质和糖元等结构，也不易使酶丢失活性，且长时间固定不会使组织变脆，因此能较好的保存组织的超微结构。

（1）戊二醛

是电镜样品制备中，最常用的固定剂之一。它作为超薄切片术的固定剂是从年开始的，至今已得到广泛使用。戊二醛对细胞的精细结构有很强的亲和力，因此是一种良好的固定剂。商品多为25％的戊二醛水溶液.

戊二醛作为生物样品的固定剂，具有以下优点：①对组织的渗透力比锇酸大，而且能保存组织内某些酶活性；②与蛋白质之间的反应较快，能较好地保存蛋白质的结构；③对细胞内的微管及滑面内质网、线粒体等膜性结构保存较好；④可以较好地固定和保存组织里的糖原，用大白鼠的肝脏可证明大约有65％的糖原可被戊二醛保存下来；⑤能够较好的固定植物组织。

戊二醛作为固定剂的主要缺点：①没有电子染色作用，单独用它固定的生物样品电子反差不好；②脂类及其他一些微细结构，在脱水时易被提取出来。

为充分发挥戊二醛固定效果，使用和储存过程中应注意：

pH和温度中性或碱性均能使戊二醛聚合，失去醛基。PH降至3.5以下时固定效力也将大幅降低。PH为5时在4℃或更低温度可保持稳定状态几个月。

氧气和浓度氧气对戊二醛溶液影响较大，应密封保存。浓度大于50％时在室温下容易聚合成胶状，低于4％的溶液较为稳妥。

杂质污染可能产生白色沉淀物，应确保玻璃器皿及水的洁净。

（2）.丙烯醛其渗透和反应速度均较快，稍大一些组织可用丙烯醛作固定液。丙烯醛和戊二醛混合液可较好保存微管。丙烯醛易燃，是危险化学品，可由呼吸系统吸入，或通过皮肤吸收，并对皮肤有强烈刺激作用。

（3）.甲醛多用于光学显微镜技术研究。电镜样品固定多用纯化的多聚甲醛，为白色粉末。分子较小，渗透组织的能力比强。但不能较好的固定细胞基质，脱水后大部分细胞基质将丢失。一般与戊二醛混合使用。

（4）.高锰酸钾一种强氧化剂,主要用于保存细胞的膜性结构，对质膜、内质网及髓鞘等结构保存良好，其他结构则保存很差。只用于研究某些常用固定液难以固定的植物和酵母样品。

戊二醛的配制

2．四氧化锇（OSO4，锇酸）

四氧化锇是一种淡黄色、具有强烈刺激味的晶体，它的水溶液呈中性，故“锇酸”二字实为一种误称。强氧化剂，具有强烈的挥发作用，挥发的蒸气具有一定毒性，对皮肤、呼吸道粘膜和角膜等都有固定损伤作用，所以在配制时应注意通风，最好在毒气橱中进行操作。

优点：能与不饱和脂肪酸反应，使脂肪酸得以固定，所以也是唯一能保存脂类的固定剂。

能固定脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定；还可与变性DNA以及核蛋白起反应。

当经OSO4固定后，金属锇可被结合在细胞结构里，因而在电镜观察时可以获得很好的图像反差，起到电子染色的辅助作用。

对缓冲液要求不高。

缺点：四氧化锇对糖类和天然DNA、RNA保存作用极差，因此单独用四氧化锇固定时，大部分碳水化合物包括糖原皆可被溶掉。

其分子较大，渗透能力较弱，在l～1.5小时内，仅渗透0.1～0.5mm，因此在取材时更应注意其大小，一般不应超过0.5—1.0mm3。

四氧化锇还是酶的钝化剂，因而不适于作细胞化学的固定。

经四氧化锇长时间的固定会造成脂蛋白复合体的溶解，使组织变脆，给切片带来困难，所以四氧化锇固定的时间不宜过长，一般应控制在1～4小时内（4℃）。四氧化锇还可与乙醇或醛类等发生氧化还原反应而产生沉淀，故用四氧化锇固定后的样品，必须用缓冲液或双蒸水彻底清洗后，才能进入乙醇溶液中脱水。

配好的四氧化锇储存液（2％的水溶液），必须贮存于棕色带磨口塞子的试剂瓶中，用蜡封好，外包黑纸，置4℃冰箱中保存待用。存放锇酸溶液的容器不干净，或配制时间过久，锇酸就会被氧化还原为黑色的OSO2、深褐色的OSO4·2H2O和OS(OH)，总称为“锇黑”，此时预先配制的四氧化锇水溶液逐渐失去原有的固定效力。因此，锇酸溶液最好在使用前配制.

3.四氧化钌

与锇酸性质相近，对细胞膜、核膜及胞质膜结构固定效果极佳。与蛋白质、糖原和单糖反应强烈。易分解，在冰箱中也极不稳定，其渗透速度比锇酸还要慢，因此只在样品需要时使用。

综上所述，各种固定剂均有其各自特点，要使组织达到良好的固定效果，常将两种固定剂配合使用，最常用的是戊二醛作前固定，锇酸作后固定。

（三）常用的缓冲液

磷酸盐缓冲液仿效细胞外液成分配成，优点是便宜，无毒性作用；缺点是久放易产生沉淀并易遭到细菌的污染。PH会随温度的变化而稍有变化，在7.5以下缓冲能力很强，控制固定液的PH值比较有效。常用于配置戊二醛固定液和多聚甲醛固定液，并适于灌流固定。

二甲砷酸盐缓冲液较稳定，能保存，不易被细菌污染，但有一定毒性，配制时要小心，应在防护罩内进行配制。尽量不与皮肤直接接触，避免呼吸道吸入。不像磷酸盐那样会与铅试剂起反应产生沉淀，因此在细胞化学中使用普遍。

（1）磷酸盐缓冲液(0.2M)

储备液：甲液0.2M磷酸氢二钠溶液

Na2HPO4·2H2O35.61g

(或Na2HPO4·12H2O71.64g)

加蒸馏水溶解成0ml

乙液0.2M磷酸二氢钠溶液

NaH2PO4·H2O27.60g)

(或NaH2PO4·2H2O31.21g)

加蒸馏水溶解成0ml

工作液：混合甲、乙二液，即可得到50ml所需pH值的缓冲液。

不同pH值0.2M磷酸盐缓冲液的配制

按上表混合后，若将溶液稀释到ml，则可配成0.1M缓冲液。

（2）二甲砷酸盐缓冲液(0.2M)

储备液甲液：二甲砷酸钠4.28mg

蒸馏水加至ml

乙液：0.2N盐酸

不同pH值二甲砷酸钠缓冲液的配制

按表8－2混合甲、乙液后，再加蒸馏水成ml，即可得到不同pH的缓冲液。该液稳定，可长期在4℃下保存。缺点是有臭味、有毒性，应在通风柜中配制。

（四）影响固定效果的因素

固定液的pH值、渗透压、固定液的温度和时间，以及缓冲液的选择等因素，都会对固定效果产生直接影响。

1．固定液的酸碱度（pH值）

固定液的酸碱度必须与被固定组织的酸碱度基本一致。大多数动物组织酸碱度的平均值是7.4，所以固定液的pH值在7.2～7.4之间，才能最好地保存动物组织的精细结构。动物组织适用pH7.4左右的固定液，植物细胞以pH6.8～7.1较好。

2．渗透压及离子组成

低渗的固定液易引起组织肿胀，高渗引起收缩。在固定液内加入适量的非电解质或电解质类物质，调节其渗透压，使之成为等渗溶液。通常使用的试剂有钾、钠、钙盐等电解质或蔗糖、葡萄糖等非电解物质。

固定液中加有两价阳离子，可以减少细胞内物质的抽提。

3．固定液的浓度

较低浓度需要较长的固定时间，易引起酶的扩散、细胞物质的抽提及组织的肿胀。过高的浓度易毁坏酶的活性及细胞的精细结构。特别是锇酸和高锰酸钾，高浓度会造成蛋白质分子的断裂。戊二醛常用浓度为1％-6％，锇酸1％-2％。含水较多的组织，一般需要较高的固定浓度。

4．固定的时间、温度和样品块的大小

在任何情况下不管使用何种固定剂，都应在温度较低的情况下进行。当前采用的标准固定时间是1－4小时，固定温度为0～4℃。由于组织样品是由表及里逐层固定的，存在着固定的梯度，所以样品的大小，直接关系到固定的均匀性.“小”的样品是实现均匀固定的最重要的条件。由于大多数固定剂，其穿透力每小时仅有0.25～0.5mm，所以在固定取材时，0.5～1.0mm3应该是较理想的电镜样品尺寸。

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