先天性遗传性角膜内皮营养不良患者SLC4

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本文原载于中华眼科杂志,,57(2)　　　　　　　　:-.DOI:10./cma.j.cn--

角膜营养不良是一类遗传性眼病，表现为角膜各层出现形态各异的沉积或混浊，基因突变是其主要病因［1,2］。先天性遗传性角膜内皮营养不良（congenitalhereditaryendothelialdystrophy，CHED）在角膜营养不良中较为罕见，表现为角膜内皮发育不全或角膜内皮细胞变性及功能减退，临床特征为双眼弥漫性角膜水肿及混浊［3］。根据年更新的国际角膜营养不良分类法的规定，CHED仅指表型更为严重的Ⅱ型CHED，呈隐性遗传方式，患者角膜水肿多开始于新生儿期，会严重影响患者视力发育，往往导致眼球震颤及严重的弱视［4,5,6］。SLC4A11（solutecarrierfamily4member11）基因是目前唯一确定与CHED相关的致病基因［7,8］。迄今为止，ClinVar数据库已收录了该基因上个突变位点（数据库更新至年6月29日），其中35个突变被判定为“有害”或“可能有害”。然而，目前已发现的SLC4A11基因突变并不能解释全部CHED病例的遗传性，仍有将近20%的CHED患者病因不清，致病突变不明确［2］。因此，对新致病突变的深入挖掘将有助于拓展CHED的遗传突变谱，进一步明确CHED的发生机制。本研究于年8月至年9月对6例CHED患者进行了全外显子组测序，旨在对CHED的分子诊断和遗传咨询提供参考。

资料和方法

一、对象

回顾性系列病例研究。本研究于年8月至年9月收集复旦大医院眼科门诊收治的CHED患者6例，均为男性，患者就诊时年龄7~29岁，平均20.5岁。诊断标准［9,10］：（1）出生时或婴幼儿期即出现双眼较为对称的角膜水肿及混浊；（2）眼科检查提示不合并其他眼前节异常，如先天性青光眼、Peters异常、先天性白内障等；（3）结合病史及眼科检查初步排除其他类型的角膜内皮营养不良，如后部多形性角膜内皮营养不良及Fuchs角膜内皮营养不良；（4）未合并全身其他系统的异常；（5）患者父母未患病；（6）角膜病理学检查结果符合CHED表现。将符合CHED诊断且临床与基因检测资料完整的患者纳入本研究。排除标准：伴有其他系统性疾病的患者，临床与基因检测信息缺乏者。对纳入患者进行的眼科检查项目包括：视力、裂隙灯显微镜、眼前节照相、非接触式眼压测量、眼部B超及眼前节相干光层析成像术等检查。此外，对于在复旦大医院行角膜移植的患者，对其患病角膜进行了病理学检查。另招募了50名无相关视力障碍病史的健康人作为Sanger测序验证的对照组。本研究流程符合《赫尔辛基宣言》的要求，已取得复旦大医院伦理委员会批准（批文号：［］伦审第044-1号），在研究之前获得所有受试者的书面知情同意书。

二、方法

1.基因组DNA提取：每位受试者取外周静脉血3ml，采用德国Qiagen公司的FlexiGene血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，于-20℃保存。

2.建库与测序：采用美国安捷伦公司的SureSelectHumanAllExonV6试剂盒对6例CHED患者的DNA样本进行外显子捕获和建库后，应用HiSeq测序平台进行高通量双端测序（2×bp）。原始数据经质量控制去除带接头、低质量片段，有效测序数据通过Burrows-WheelerAligner软件比对到参考基因组（GRCh37/hg19）后，经GATK软件进行流程分析及ANNOVAR软件注释后获得编码区、剪切位点和非翻译区的全部突变位点信息（包括单核苷酸突变及插入或缺失突变）。

3.候选突变筛选及分析：基于本课题组前期已建立的候选突变筛选流程进行后续分析［11］，包括：保留测序深度大于10×的非同义突变；去除常见突变（在千人基因组、gnomAD数据库中的突变频率1%）；去除对蛋白无害的突变［基于SIFT（sortsintolerantfromtolerant）、PolyPhen2及MutationTaster3个生物信息学软件的预测结果］；根据《美国医学遗传学与基因组学学会遗传突变分类标准与指南》［12］、结合突变在人群中的发生频率、遗传模式、基因功能及突变的有害性预测结果、基因型-表型相关性及已有文献报道等分析数据对突变的致病性进行预测评级。

4.Sanger测序验证：用Sanger测序对患者及50例对照样本进行突变位点验证，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，序列见表1。聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）体系：TakaraPrimeSTARMAX预混液（2×）25μl，正向、反向引物各2μl，二次蒸馏水19μl，DNA模板2μl。PCR循环条件：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，共进行30个循环。PCR产物由苏州金唯智生物科技有限公司进行纯化测序，测序结果与GeneBank数据库的原始序列采用Blast算法进行比对，并对序列图谱进行分析，以确定是否存在基因突变。

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表1

SLC4A11基因不同突变位点的聚合酶链式反应引物序列

表1

SLC4A11基因不同突变位点的聚合酶链式反应引物序列

突变位点正向引物序列反向引物序列exon10GTCCATGCGTAGAAGGAGTTGACACTGATGGTACGTGGCCTCTexon16TTCACGTTCACAATCCTGCGATAGCAGTAGCCTGTCCCCTexon17ACCCTCCGGATGTAGTGTGTTATGACACGTGAGTGTGAGGCexon18GATGAGCCTGGGTCAGAGAGAAGGAAGATCCACTACTTCACGGG

结果

一、临床表型

本研究纳入的6例CHED患者一般资料见表2。所有患者均主诉自幼双眼发白，视力不佳。矫正角膜厚度因素后所测得眼压均属于正常范围。其中3例患者在复旦大医院眼科接受穿透性角膜移植术（例1、2、5）（图1），术前裸眼视力为眼前手动或指数，术后视力0.1~0.3。患者的病理学检查结果显示角膜上皮厚薄不均或有大泡形成、前弹力层缺损、基质水肿增厚、后弹力层增厚及内皮缺失（图2）。临床诊断为CHED。余3例患者未行手术治疗，视力分别为0.01（例3）、0.1（例4）及0.15（例6）。

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表2

6例先天性遗传性角膜内皮营养不良患者的临床基本资料

表2

6例先天性遗传性角膜内皮营养不良患者的临床基本资料

例序年龄（岁）性别术前视力术后视力男眼前手动0.男数指0.男0.男0.男眼前手动0.男0.15

注：表内空项示患者未行手术无术后视力

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图1

6例先天性遗传性角膜内皮营养不良患者双眼眼前节外观A、B分别示例1患者的右眼和左眼；C、D分别示例2患者的右眼和左眼；E、F分别示例3患者的右眼和左眼；G、H分别示例4患者的右眼和左眼；I、J分别示例5患者的右眼和左眼；K、L分别示例6患者的右眼和左眼

图1

6例先天性遗传性角膜内皮营养不良患者双眼眼前节外观A、B分别示例1患者的右眼和左眼；C、D分别示例2患者的右眼和左眼；E、F分别示例3患者的右眼和左眼；G、H分别示例4患者的右眼和左眼；I、J分别示例5患者的右眼和左眼；K、L分别示例6患者的右眼和左眼

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图2

光学显微镜下观察先天性遗传性角膜内皮营养不良患者（例1）左眼穿透性角膜移植术中取下的左眼角膜A示HE染色，可见上皮水肿，基质水肿增厚伴纤维排列紊乱，内皮细胞稀少缺失HE染色×；B、C分别为A图中上、下两个虚线框内的局部放大图像，可见后弹力层明显增厚（箭头）HE染色×；D、E、F分别示刚果红染色、Masson染色及PAS染色结果均为阴性×

图2

光学显微镜下观察先天性遗传性角膜内皮营养不良患者（例1）左眼穿透性角膜移植术中取下的左眼角膜A示HE染色，可见上皮水肿，基质水肿增厚伴纤维排列紊乱，内皮细胞稀少缺失HE染色×；B、C分别为A图中上、下两个虚线框内的局部放大图像，可见后弹力层明显增厚（箭头）HE染色×；D、E、F分别示刚果红染色、Masson染色及PAS染色结果均为阴性×

二、全外显子组测序结果

经全外显子组测序后，平均每个样本产生3.9×对测序片段（reads）。目标区域的平均测序深度为×；目标区域的覆盖度（测序深度10×）达到99.3%以上，表明全外显子组捕获成功，测序质量可靠。测序数据经本课题组已有的候选突变筛选流程分析后，在4个患者的样本中发现SLC4A11基因上的6个突变可能与疾病表型有关。这6个SLC4A11基因突变在健康人群的突变频率极低，经SIFT、PolyPhen-2和MutationTaster预测均为有害突变。根据《美国医学遗传学与基因组学学会遗传突变分类标准与指南》，结合突变的发生频率、功能及有害性预测、遗传模式、基因型表型相关性以及已有文献报道等数据对突变的致病性进行评级：4个错义突变位点以往均有报道，其致病性等级为“致病（P）”或“可能致病（LP）”；新剪切位点突变c.0+1GT的评级为“致病性不明确（US）”，突变证据为PVS1_moderate+PM2+PP4；新移码突变c._del（p.Phefs）的评级为“致病（P）”，突变证据为PVS1+PM2+PP4（表3）。

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表3

4例先天性遗传性角膜内皮营养不良患者的6个SLC4A11基因突变筛查结果

表3

4例先天性遗传性角膜内皮营养不良患者的6个SLC4A11基因突变筛查结果

例序及突变碱基改变（NC_.10）cDNA改变（NM_034）氨基酸改变（NP_.1）突变类型基因型生物信息学分析软件预测结果agnomAD频率ACMG评级b1

突变1

g.GAc.CT(exon18）p.ArgCys错义突变杂合均为有害突变8.15×10-6LP

突变2

g.CAc.0+1GT(exon10）剪切突变杂合仅MutationTaster软件预测为有害突变US2

突变1

g.GAc.CT(exon17）p.ProLeu错义突变杂合均为有害突变LP

突变2

g._delc._del(exon16）p.Phefs移码突变杂合P3g.CTc.GA(exon18）p.ArgHis错义突变纯合均为有害突变1.22×10-5LP4g.GAc.CT(exon17）p.ArgTrp错义突变纯合均为有害突变8.17×10-6P

注：aSIFT(sortsintolerantfromtolerant)、PolyPhen-2、MutationTaster3种生物信息学软件的预测结果；bACMG示美国医学遗传学与基因组学学会，根据该学会制定的指南中对基因突变的致病性评级标准，US示致病性不明确，LP示可能致病，P示致病；表内空项示无此项数据

三、Sanger测序验证SLC4A11基因突变位点

在4例CHED患者中发现的6个SLC4A11基因突变位点，经Sanger测序后均得到证实，50名健康对照中均未检测到相应突变。Sanger测序图谱见图3。

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图3

4例先天性遗传性角膜内皮营养不良患者的SLC4A11基因突变位点Sanger测序结果（灰色底纹示突变位点）A示例1患者g.GA杂合突变；B示例1患者g.CA杂合突变；C示例2患者g.GA杂合突变；D示例2患者g._del杂合突变；E示例3患者g.CT纯合突变；F示例4患者g.GA纯合突变

图3

4例先天性遗传性角膜内皮营养不良患者的SLC4A11基因突变位点Sanger测序结果（灰色底纹示突变位点）A示例1患者g.GA杂合突变；B示例1患者g.CA杂合突变；C示例2患者g.GA杂合突变；D示例2患者g._del杂合突变；E示例3患者g.CT纯合突变；F示例4患者g.GA纯合突变

讨论

CHED是由SLC4A11基因突变所导致的常染色体隐性遗传性角膜病变，表现为严重的视力缺陷。本研究对6例CHED患者进行了全外显子组测序，在其中4例患者基因组中检测出6个不同的SLC4A11基因突变，包括4个错义突变、1个移码突变、1个剪切位点突变。其中4个错义突变为CHED的已知致病突变［13,14,15,16］，而剪切位点突变c.0+1GT和移码突变c._del（p.Phefs）为本研究首次报道，根据《美国医学遗传学与基因组学学会遗传突变分类标准与指南》，新发现的移码突变和剪切位点突变的致病性等级分别为“致病”和“致病性不明确”。

SLC4A11基因位于人类第20号染色体短臂端，包含20个外显子，其蛋白产物由个氨基酸构成，是溶质载体家族成员之一，负责编码电压门控-钠离子偶联的硼酸盐共转运蛋白，对细胞内硼酸盐稳态、细胞生长和增殖起关键作用。SLC4A11蛋白由2个结构域构成，分别是个氨基酸组成的胞质结构域以及个氨基酸组成的膜结构域［17］。基于蛋白质结构的3D同源建模研究发现，SLC4A11蛋白的膜结构域共包含14个跨膜区域，是其介导H+（OH-）以及NH3-H+离子跨膜转运的关键结构域［18,19］。SLC4A11基因表达定位于角膜内皮细胞的基底外侧膜，该基因突变除可导致CHED发病外，还与Fuchs角膜内皮营养不良［20,21,22］及Harboyan综合征（同时伴有先天性耳聋和角膜混浊症状）［23,24,25］的发生密切相关。Alka和Casey［18］进一步研究了不同SLC4A11基因突变对蛋白细胞膜定位的影响。结果显示，61%（19/31）的CHED致病突变及3/5的Harboyan综合征致病突变严重阻碍SLC4A11蛋白向细胞膜转运，导致蛋白在内质网中滞留，而Fuchs角膜内皮营养不良的致病突变对SLC4A11蛋白膜定位的影响则相对较弱，这可能与致病突变在SLC4A11蛋白中的位置有关。截至目前已发现的CHED致病突变大多位于SLC4A11蛋白的14个跨膜区域中，可能对角膜内皮细胞的泵功能有重要影响。本研究报道的4个错义突变（p.ArgTrp、p.ProLeu、p.ArgHis和p.ArgCys）分别位于第11、14个跨膜区域，新发现的移码突变p.Phefs位于第9个跨膜区域，可能影响蛋白的正确折叠和定位，但具体作用机制有待进一步研究。

在本研究纳入的另外2例CHED患者基因组中并未检测到SLC4A11基因致病突变，这可能与CHED的遗传突变谱尚未被完全揭示有关。既往研究对CHED患者的基因筛查也仅在82%的患者中发现SLC4A11基因的编码区突变［2］，仍有一部分患者的致病突变不明确，提示SLC4A11基因突变并不能解释全部CHED的遗传性，新的致病基因有待进一步挖掘。另一方面，由于全外显子组测序技术所限，本研究仅对基因编码区的单核苷酸突变和插入或缺失突变做了筛选分析，大的基因组结构突变及拷贝数突变不在本研究范围内。上述2例CHED患者的SLC4A11基因是否存在结构突变或拷贝数突变等异常有待采用其他技术（如全基因组测序等）做进一步验证。此外，本研究未能采集到全部患者父母的DNA样本，对于例1和例2患者携带的SLC4A11基因双杂合突变，无法判定它们是否分别来自父亲和母亲，因此也无法判定它们是否为复合杂合突变。

综上所述，本研究通过全外显子组测序鉴定出4例CHED患者所携带的SLC4A11基因致病突变，其中剪切位点突变c.0+1GT和移码突变c._del（p.Phefs）为新发现的突变，该发现进一步拓展了CHED的遗传突变谱，对CHED的分子诊断和遗传咨询提供了参考。

利益冲突

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献

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