角膜上皮屏障功能的研究现状

作者：刘凡菲李炜刘祖国陈文生

来源：中华眼科杂志,,52(08):-.

摘要

角膜上皮位于眼球壁的最外层，是外界物质进入眼内的主要通道。在生理状态下，角膜上皮表层细胞之间相互作用，形成一道具有选择性通透功能的屏障。完整的角膜上皮屏障功能不仅能保证正常代谢所需的营养物质进入眼内，而且能防止外界异物或致病微生物侵袭。最近，大量的临床及实验研究表明，角膜上皮屏障功能异常是许多眼表疾病发生、发展的病理学基础。此外，研究发现参与构成角膜屏障功能的多种蛋白质还参与细胞的增殖、分化、凋亡等一系列生理和病理过程。本文回顾总结了近年来关于角膜上皮屏障结构、功能及其影响因素等研究的现状。

角膜上皮表层细胞之间通过细胞连接相互作用，形成具有选择性通透作用的功能性屏障。正常的角膜上皮屏障功能不仅能保障代谢所需的营养物质进入眼内，而且能避免异物和致病微生物侵袭。角膜上皮是眼球防御外界致病因子侵袭的第一道结构性防线，其屏障功能对异物或致病微生物的侵袭及周围环境的改变十分敏感。目前已知眼外伤、炎性反应、代谢紊乱、局部用药等因素，均会直接引起角膜上皮表层细胞连接蛋白质分布及表达量的改变，进而导致角膜上皮屏障功能丧失。因此，角膜上皮屏障功能障碍是多种眼表疾病发生、发展的病理学基础。令人感兴趣的是，研究还发现参与构成角膜上皮屏障功能的多种蛋白质，同时参与调控角膜上皮细胞一系列生理和病理过程，如增殖、分化、凋亡等。鉴于角膜上皮屏障功能所具有的重要作用，相关研究一直是眼科临床的热点之一。

1一、参与构成角膜上皮屏障的主要蛋白质及其功能

外界物质通过角膜上皮进入眼内的通路包括细胞内通路和旁细胞通路。细胞内通路为主动转运过程，常需要消耗能量；而旁细胞通路物质交换的动力主要来自组织内外的渗透压差，故无需额外耗能，是一种"经济的"物质交换方式。由角膜上皮表层细胞间紧密连接与黏着连接所构成的屏障，使旁细胞通路具有选择通透性，即一方面保障眼内代谢所需的营养物质进入，另一方面可以防止异物及致病微生物进入眼内，从而使角膜代谢处于平衡状态。

角膜上皮屏障由紧密连接和黏着连接构成。紧密连接位于相邻角膜上皮表面细胞质膜的顶端，在屏障功能的建立和细胞极性维持过程中发挥重要的作用。紧密连接由细胞膜蛋白质（如ZO-1、ZO-2、ZO-3）和跨膜蛋白质（如occludin、claudin）及结合黏分子等共同构成。紧密连接蛋白质中ZO-1是角膜上皮紧密连接的标志物。ZO-1、ZO-2和ZO-3是膜相关鸟氨酸激酶同系物蛋白质家族的成员，这些分子直接或间接地与多种细胞内蛋白质，尤其细胞骨架蛋白质F-actin连接，构成紧密连接复合体。claudin和occludin形成了紧密连接的侧链蛋白质，并与相邻细胞的侧链相连，形成一对链结构，填补细胞间隙。

黏着连接位于紧密连接下方，发挥着细胞间的黏着作用和维持紧密连接蛋白质稳定性的作用。主要包括细胞间连接和细胞与外基质连接，由跨膜糖蛋白质家族cadherin（如E-cadherin）和catenin蛋白质家族（如p-catenin、β-catenin、α-catenin）等共同构成。黏着连接与细胞骨架蛋白质F-actin相结合，参与细胞间连接架构的维持和细胞基本活动的调控。

部分紧密连接蛋白质和黏着连接蛋白质在维护角膜上皮屏障功能的同时，还参与细胞的增殖、分化等过程。紧密连接蛋白质ZO-1可以调控细胞的增殖、生长密度和形态。当细胞密度达到一定阈值使ZO-1过表达时，ZO-1介导的核酸结合蛋白质和细胞分裂激酶4生成减少，细胞增殖暂停。黏着连接蛋白质β-catenin参与Wnt信号通路。Wnt信号通路一旦激活，β-catenin从胞质向胞核转移，在核内与T细胞因子或淋巴增强因子相结合，调控靶基因的表达，从而调节细胞的增殖。

2二、角膜上皮屏障功能的检测方法

（一）泪液清除率

临床可根据泪液清除率确定角膜上皮的屏障功能。在被检者眼部点入荧光素染料，用荧光光度计测量泪液中荧光素浓度的改变，可定量检测角膜上皮的屏障功能。

（二）活体共焦扫描激光显微镜

临床使用活体共焦扫描激光显微镜观察被检者角膜上皮细胞的形态，可以初步了解上皮细胞间的连接情况，从而推测角膜上皮屏障功能的变化。在活体共焦扫描激光显微镜下，正常的角膜上皮细胞边界整齐规则，大小一致。若细胞边界模糊、分布紊乱、相互分离、大小不一，则提示角膜上皮屏障功能有所破坏。

（三）跨上皮电阻（transepithelialelectricalresistance，TER）

紧密连接蛋白质侧链的数目和紧密连接蛋白质复合体的完整性与TER呈指数正相关。将电子伏欧表的2个电极置于体外培养的单层细胞，得到的电阻值可以用来评价角膜上皮屏障功能。

Kusano等发现电子伏欧表不仅可以测量体外培养的单层细胞TER，还可以测量活体兔角膜的TER。为了避免角膜损伤，Uematsu等将上述方法改进，提出了一种无损伤测量活体角膜上皮屏障功能的方法，即将一侧电极置于结膜，另一侧电极置于角膜表面测量TER，从而避免了眼内组织的损伤。

3三、引起角膜上皮屏障功能异常的常见原因

（一）外伤

外伤可以直接使角膜上皮细胞脱落，导致屏障功能丧失。

（二）炎性反应

炎症介质可导致角膜上皮连接蛋白质的分布和表达量改变，细胞骨架蛋白质F-actin不规则重构，角膜上皮屏障功能受损。

不同的炎症介质导致紧密连接蛋白质的变化不同。肌球蛋白质轻链激酶（myosinlightchainkinase，MLCK）是肌动蛋白质和肌球蛋白质之间主要的调节因子，通过连接肌动蛋白质丝来维持角膜上皮的屏障功能。肌球蛋白质轻链（myosinlightchain，MLC）的磷酸化作用可改变肌动蛋白质F-actin的结构，破坏上皮屏障功能。组胺与H1受体结合，产生的MLC磷酸化作用使F-actin结构皱缩，屏障结构丧失完整性。转化生长因子（transforminggrowthfactor，TGF）α通过激活核因子kappaB（nuclearfactorkappaB，NF-κB）信号通路，可诱导MLC磷酸化，破坏ZO-1的结构。IL-1β也能激活NF-κB信号通路，诱导MLC磷酸化作用，破坏ZO-1和occludin的正常结构。Contreras-Ruiz等发现在体外培养的人角膜上皮细胞系（humancornealepithelialcellline，HCE）中加入肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）α、TGF-β、IL-13、IL-17、IL-6后，ZO-1、ZO-2、occludin等结构崩解，蛋白质结构由均一的分布变成弥散不连续的点状结构，排列不规则。

炎症因子还会影响紧密连接蛋白质的表达，如TNF-α、IL-13可显著降低claudin-1的mRNA表达，IL-17、IL-6可降低ZO-2的mRNA和蛋白质表达等。

（三）泪膜异常

泪膜异常是导致角膜屏障功能障碍、视觉误差、痛觉过敏等角膜病变的常见原因。泪膜异常伴随泪液渗透压升高以及基质金属蛋白质酶（matrixmetalloproteinase，MMPs）、炎症趋化因子增加。这些泪液成分变化会破坏紧密连接蛋白质，促进上皮细胞的凋亡和分离，造成泪膜不稳定、角膜上皮表面不规则和神经敏感度变化。

在泪液高渗透压环境中，角膜上皮的丝裂原活化蛋白质激酶（mitogenactivatedproteinkinase，MAPK）和NF-κB信号通路被激活，继而启动一系列反应，包括炎症编码基因激活，细胞活素、趋化因子、MMPs、促凋亡因子以及角质化蛋白质增多。被激发的MMP-9会水解紧密连接蛋白质复合体，促使角膜上皮细胞分离，眼表的润滑度降低，眼表摩擦力增加，从而易引发丝状角膜炎。临床上干眼患者常伴发眼表炎性反应、泪液渗透压增高、MMP-9表达上调。细胞外基质金属蛋白质诱导酶可通过诱导产生MMP-9，使occludin分布紊乱。IL-17可上调MMP-9的表达，影响角膜上皮屏障功能。

干燥环境是泪膜异常的常见诱因。研究发现干燥环境导致的角膜上皮屏障功能变化与c-Jun氨基末端激酶信号通路有关，其通过该信号通路使MMPs产物生成增加。

（四）神经麻痹及神经营养因素

角膜的神经支配对维持角膜上皮的完整性和屏障功能至关重要。角膜神经麻痹是角膜上皮病变的诱因之一。支配角膜的三叉神经损伤后，可导致角膜上皮屏障功能障碍，随着病情的发展，出现角膜溃疡、瘢痕、变薄甚至穿孔等一系列病变。

三叉神经损伤可引起泪液分泌减少，导致角膜上皮屏障功能破坏。研究发现皮下注射辣椒素可导致角膜神经营养性病变，角膜上皮屏障功能受损，上皮损伤愈合时间延迟。

（五）防腐剂

研究发现局部应用苯扎氯铵可导致角膜上皮表层细胞的ZO-1和ZO-2分布紊乱，上皮屏障功能受损，并伴随上皮表层细胞凋亡。进一步的研究发现，局部应用抗青光眼常用药物前列腺素类似物，如拉坦前列腺素、曲伏前列腺素、贝美前列腺素滴眼液后，角膜上皮屏障功能受到快速破坏。其原因为上述眼液可引起角膜上皮表层ZO-1和occludin分布紊乱，瓦解F-actin的细胞骨架结构。Nakagawa等发现角膜上皮屏障功能在细胞活力变化之前就已发生改变，说明屏障功能对于药物毒性较细胞活性更为敏感。以上研究提示角膜上皮屏障功能可以作为评价药物毒性的一项敏感指标。

（六）缺氧

Kimura等发现缺氧可导致HCE细胞间ZO-1的分布改变和蛋白质表达下调，细胞间TER下降。Yanai等给兔配戴透氧性不同的两种角膜接触镜后，发现配戴相对低透氧度接触镜的兔角膜上皮细胞的ZO-1结构紊乱，蛋白质表达量下调，角膜上皮渗透性增加。Ding等给恒河猴配戴低透氧的角膜塑形镜后，发现恒河猴角膜上皮细胞间的连接变得松散，角膜上皮屏障功能减弱。相关研究报道人长期配戴角膜接触镜，铜绿假单胞菌等细菌损伤并穿过角膜上皮屏障的概率增高，易导致角膜感染。提示配戴角膜接触镜导致的缺氧可使角膜上皮屏障功能出现障碍，增加角膜接触镜表面游离病原体进入眼内的可能性。

（七）其他因素

细胞外调节蛋白质激酶（extracellularregulatedproteinkinases,ERK)信号通路的高水平磷酸化作用，使ZO-1和occludin分布紊乱，TER降低。Toll受体蛋白质3（tolllikereceptor3，TLR3）的激活，可以下调细胞连接蛋白质E-cadherin的表达，破坏角膜上皮屏障功能。此外，目前发现Klf4基因、Notch1基因与角膜上皮屏障功能的调控相关，敲除这两个基因后角膜上皮屏障功能有不同程度的减弱。研究报道在春季角结膜炎患者中，肥大细胞释放的糜蛋白质酶会水解occludin和纤维连接蛋白质，破坏角膜上皮屏障功能，抑制角膜上皮细胞的迁移。还有学者研究发现角膜的渗透性会随年龄的增长而增大，从而导致角膜上皮细胞屏障功能的亚临床损伤，角膜的防御能力变得薄弱。

虽然完整的角膜上皮屏障功能是预防角膜感染和维持角膜上皮细胞正常新陈代谢的重要因素，但是角膜上皮屏障功能的破坏与角膜感染并不直接相关。说明角膜感染受到多种因素的调控，角膜上皮屏障功能破坏可增加细菌穿透上皮感染角膜的可能性。而屏障功能破坏后是否出现角膜感染，还与其他因素，如表面活性蛋白质D表达、年龄等相关。

4四、促进角膜上皮屏障功能恢复的药物

临床上针对恢复角膜上皮屏障功能的药物很少，大多是利用药物的抗炎作用来修复屏障功能，一些局部营养物质也可以加强角膜上皮的屏障功能。

（一）抗炎药物

1．糖皮质激素类药物和多西环素：

甲强的松龙和多西环素可抑制干眼的炎性反应，减少炎症细胞因子，如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和粒-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，GM-CSF）的产生和MMP-9产物的出现，从而保护角膜上皮屏障功能。Kimura等发现地塞米松可抑制缺氧导致的HCE细胞间ZO-1分布改变和蛋白质表达下调，其原因为地塞米松能抑制缺氧条件下HCE细胞MLCK基因的活化和表达，降低MLC的磷酸化作用，促进角膜上皮屏障功能的恢复。

2．瑞巴派特：

瑞巴派特是一种通过增加胃黏膜分泌前列腺素促进胃溃疡愈合的抗炎药物。Tanaka等发现瑞巴派特可以上调体外培养HCE的紧密连接蛋白质ZO-1的表达。Kimura等发现瑞巴派特能抑制TNF-α诱导的HCE细胞MLC磷酸化作用和细胞骨架蛋白质F-actin的不规则重构，维持ZO-1的正常分布和表达。

3．姜黄素（curcumin）：

研究发现姜黄素参与阻断NF-κB信号通路，抑制TNF-α和IL-1β对角膜上皮屏障的破坏作用。作用机制为抑制炎性反应发生时NF-κB信号通路的MLC磷酸化，减轻对于连接蛋白质ZO-1和occludin的破坏。

（二）维生素

研究报道1,25-二羟基维生素D3和25-羟基维生素D3能够上调紧密连接蛋白质occludin的表达，增加TER，降低角膜渗透率，增强HCE细胞的屏障功能。

（三）ERK信号通路抑制剂

研究发现抑制ERK信号通路的磷酸化作用，可以阻断其对于连接蛋白质的破坏。角质化细胞生长因子（keratinocytegrowthfactor，KGF）能抑制ERK信号通路产生的磷酸化作用，减轻缺氧对ZO-1分布的破坏。Wang等发现将佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（phorbol12-myristate13-acetate，PMA）加入体外培养的HCE后，对PMA敏感的部分激活蛋白质激酶C（proteinkinaseC，PKC）会激活MAPK，促进ERK信号通路的磷酸化作用，导致紧密连接蛋白质破坏。特异的MAPK信号通路抑制剂，如PD可以抑制ERK信号通路的磷酸化作用，恢复角膜上皮屏障功能。

（四）神经营养物质

Ko等研究发现，在体外培养的HCE中加入P物质（substanceP，SP），可上调细胞间ZO-1的表达量，这一作用随时间和浓度的增加而增强。加入SP后细胞层的TER增大，上皮屏障功能增强。Nakamura等联合使用SP和胰岛素样生长因子（insulinlikegrowthfactor-1，IGF-1）滴眼液后，神经营养性角膜病变大鼠的荧光素摄取量降低，上皮屏障功能增强，角膜的创伤愈合加快。Nagano等的研究也证实了SP和IGF-1联合治疗，可以增强神经营养不良性角膜病变大鼠的角膜上皮屏障功能，促进损伤后的角膜愈合过程。

（五）生长因子

肝细胞生长因子（hepatocytegrowthfactor，HGF）可以防止HCE在缺氧时的ZO-1结构消失、表达下调。HGF通过维持ZO-1的正常表达和分布，以保护HCE细胞间的屏障。此外，HGF还可以抑制细胞骨架蛋白质F-actin的重构，加强其对于角膜上皮屏障的保护作用。

5五、角膜上皮屏障功能的研究展望

在基础研究工作中，进一步探讨角膜上皮细胞连接蛋白质在细胞增殖、分化、凋亡甚至免疫反应过程中的作用，将有助于揭示角膜疾病的发病机制。

在临床工作中，眼科医师应在感染性角膜疾病治疗中注重上皮屏障功能的恢复，尽量消除引起角膜上皮屏障功能障碍的各种诱因，从而达到预防和治疗角膜疾病的目的。此外，明确临床评估角膜上皮屏障功能的方法和标准，将有利于角膜疾病的早期诊断。

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